إذا كان الـ PCR التقليدي بمثابة "زجاج تكبير" للبيولوجيا الجزيئية، فإن الـ PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) يعمل كمجهر دقيق." هذه التكنولوجيا المتقدمة لا تضخم فقط تسلسلات الجينات المستهدفة " " بل تتعقب أيضاً عملية التضخم في الوقت الحقيقي "، مما يسمح بتحديد الكم الدقيق لمستويات التعبير الجيني.يمثل الانتقال من التقديرات التقريبية لـ PCR النقطة النهائية إلى دقة وكفاءة PCR في الوقت الحقيقي تطورًا لا مفر منه في أبحاث البيولوجيا الجزيئية الحديثة.
تفاعل سلسلة البوليمراز (بي سي آر) ، وهي تقنية ثورية في علم الأحياء الجزيئية، تستخدم أوليغونوكليوتيد خاص بالسلسلة،والدوران الحراري الدقيق لنسخ تسلسلات الحمض النووي أو الحمض النووي المشترك بشكل كبير، لتحقيق تضخيم مليون مرة. Traditional endpoint PCR requires post-reaction detection and quantification through gel electrophoresis and image analysis—a time-consuming process with limited precision that struggles to meet growing demands for quantitative analysis.
ق-بي سي آر في الوقت الفعلي قد غير هذا المشهد من خلال مراقبة توليد المنتجات خلال كل دورة بي سي آر. من خلال تتبع مرحلة التضخيم الأسهمية،يمكن للباحثين تحديد كميات تسلسل الهدف الأولي بدقة استثنائيةبينما يضاعف PCR نظرياً جزيئات الهدف في كل دورة، أثبتت المحاولات المبكرة لتحديد كمية المواد المبدئية من خلال أعداد الدورات وقياسات منتجات النقطة النهائية أنها غير موثوقة.ظهرت QPCR في الوقت الحقيقي لتلبية احتياجات الكميات القوية، في حين أن PCR في النقطة النهائية لا يزال مفيدًا بشكل أساسي لتضخيم شظايا الحمض النووي المحددة للتسلسل والإستنساخ وغيرها من تطبيقات علم الأحياء الجزيئي.
تقيس التكنولوجيا محتوى الحمض النووي بعد كل دورة باستخدام الأصباغ الفلوريسنتية التي ترتبط بمنتجات PCR (amplicons). ترتبط كثافة الفلوريسنت بشكل مباشر مع كمية amplicon ،السماح بكمية مبالغ النموذج الأولي من خلال مراقبة تغيرات الإشاراتالمراسلون الفلورسنتات الشائعة تشمل:
أدوات متخصصة تجمع بين الدورة الحرارية مع مسح الفلوريسنس لإنشاء منحنيات تضخيم (الشكل 1) التي ترسم كثافة الفلوريسنس مقابل أرقام الدورة ،يمثل تراكم المنتج خلال عملية PCR.
أصبحت هذه التكنولوجيا المعيار الذهبي للكشف عن الحمض النووي والحمض النووي النووي والكمية، وتحقق دقة مضاعفة مع نطاقات ديناميكية تمتد إلى 6-8 أوامر من الكبر.
بروتوكول PCR قياسي في الوقت الحقيقي يعمل 40 دورة، كل دورة تتكون من:
يذوب الحضانة عالية درجة الحرارة (عادة 95 درجة مئوية) الحمض النووي ذو الخيوط المزدوجة إلى خيوط واحدة مع تعطيل الهياكل الثانوية. قد تتطلب القوالب الغنية بالجينوكسيل الغازية أوقات إزالة طبيعة طويلة.
تتجانس التسلسلات التكميلية عند درجات حرارة 5 درجة مئوية أقل من درجة حرارة انصهار المبتدئ (Tm).
يعمل البوليمراز الحمض النووي بشكل مثالي عند 70-72 درجة مئوية ، حيث يمتد البرايمر بمعدلات تصل إلى 100 قاعدة / ثانية. بالنسبة للأمبليكونات الصغيرة ، غالبًا ما تندمج هذه الخطوة مع التسخين عند 60 درجة مئوية.
هذا النهج ينسخ الرنا عكسياً أولاً إلى الحمض النووي المضاد باستخدام النسخة المنسقة العكسية (RT) مع العشوائيات أو أوليغو ((dT) أو البرايمر المحدد للجينات.حوالي 10% من الحمض النووي المشترك يتم نقلها إلى أنابيب منفصلة لـ PCR في الوقت الحقيقيالمزايا تشمل:
يقلل الجمع بين تخليق الحمض النووي المشترك (cDNA) و PCR في أنبوب واحد من مخاطر التلوث وأخطاء التعامل. تتطلب هذه الطريقة بدائل محددة للجينات لمنع المنتجات غير المحددة ،مما يجعلها مثالية لتطبيقات عالية الإنتاجية.
يعمل الـ PCR في الوقت الفعلي بمهام حاسمة في:
التكنولوجيات الناشئة مثل PCR الرقمية وتحليل الذوبان عالي الدقة تعد بتوسيع تطبيقات PCR في الوقت الحقيقي. أدوات الجيل القادم توفر حساسية عالية، سرعة،وقدرات تحليل البياناتويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية الطب الشخصي، ومراقبة البيئة،اختبار سلامة الغذاء ◄وضع PCR في الوقت الحقيقي كأداة لا غنى عنها للتقدم العلمي والصحة العامة.
اتصل شخص: Ms. Lisa
Arabic
