مدونة حول المبادئ الرئيسية وإصلاح الأخطاء لمجموعات استخراج الأحماض النووية

استخراج الحمض النووي هو حجر الزاوية للتجارب البيولوجية الجزيئيةالعديد من الباحثين يجدون أنفسهم في حيرة، وخاصة عند إصلاح النتائج غير المتوقعة. This article demystifies the scientific principles underlying nucleic acid extraction kits while providing practical troubleshooting guidance to transform this essential technique from a "black box" operation into a predictable، عملية فعالة

تستخدم معظم مجموعات استخراج الأحماض النووية التجارية تكنولوجيا عمود دوران غشاء السيليكا، مع خمس مراحل حرجة: تحلل الخلايا، ربط الأحماض النووية، الغسيل والتنقية، التجفيف،والانبعاث النهائيكل خطوة تبني على الخطوة السابقة مما يعني أن أي خطوة خاطئة يمكن أن تعرض عملية استخراج كاملة للخطر

يُمثّل التحلل الخلوي الفعال الخطوة الأولى الحاسمة. تتفاوت صيغ محافظ التحلل حسب ما إذا كان يتم استخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزيني.ولكنها عادة تحتوي على تركيزات عالية من الأملاح الساخنة التي تخدم أغراض مزدوجة:

• تغيير طبيعة البروتين:هذه الملحات تعطل روابط الهيدروجين وقوى فان دير فالز والتفاعلات الهيدروفوبية، مما يزعزع استقرار البروتينات (بما في ذلك النيوكليازات) لمنع تدهور الأحماض النووية.
• تسهيل ربط السيليكا:تُحرك جزيئات المياه من الأحماض النووية، مما يخلق ظروفًا مثالية لنقلها إلى أغشية السيليكا.

الملحات الشائعة تشمل غوانيدين هيدروكلوريد، غوانيدين ثيوسيانات، اليوريا، و بيركلورات الليثيوم. وغالبا ما يتم إضافة مواد التنظيف للمساعدة في تذوب البروتين وتحلل الخلايا.حسب نوع العينةيمكن أيضًا دمج الإنزيمات. البروتيناز كيه هضم البروتينات بفعالية في مستحضرات الأحماض النووية، وخاصة في ظل ظروف التنوير. الليزوزيم هو إنزيم شائع آخر.على الرغم من أن نشاطه ينخفض في ظل ظروف التنوير.

يختلف استخراج البلازميد بشكل كبير عن عزل الحمض النووي الحمض النووي أو الحمض النووي الجينومي. يكمن التمييز الحاسم في فصل الحمض النووي البلازميد من الحمض النووي الجينومي أولاً.إضافة الملحات الساخرة على الفور سوف يطلق جميع أنواع الحمض النووي بشكل عشوائيولذلك، فإن بروتوكولات البلازميدات عادة ما تُدخِل الكاوتروبات بعد تحلل الخلايا الأولي.

وبالإضافة إلى التحلل، تساعد الملحات الساخرة في ربط الأحماض النووية بأعمدة السيليكا. يزيد الإيثانول (أو أحيانا الإيزوبروبانول) من هذا الربط.تحتوي أعمدة السيليكا على رزين يربط بشكل انتقائي الحمض النووي أو الحمض النووي الحمض النووي بناءً على تركيز الملح وعوامل أخرىتظهر الأحماض النووية الناتجة نقاءً عالياً مناسبة للستنسخ والترتيب الطويل القراءة وتطبيقات أخرى.

تركيز الإيثانول يثبت أنه حرج، فالإيثانول الزائد يُحاصِل المواد المتدهورة والجزيئات الصغيرة، مما يؤثر على قراءات امتصاص A260.عدم كفاية الإيثانول قد يعيق إزالة الملح من الأغشيةيتم تحسين كميات الإيثانول المقدمة من قبل، ولكن إذا بدا أن الحمض النووي المتدهور يشوه قراءات A260، قد يساعد إعادة تحسين تركيز الإيثانول.يمكن حفظ محلولات التدفق من خلال التساقط لاستعادة الأحماض النووية المفقودةعندما تستخدم مواد التنظيف التي تحتوي على SDS في التحلل ، فإن NaCl بمثابة مفرط فعال يتجنب تلوث مواد التنظيف.

بعد الطرد المركزي للليزات من خلال أغشية السيليكا، تلتصق الأحماض النووية المستهدفة بالعمود بينما تبقى البروتينات والسكرات البوليسكاريدية في التدفق.الأغشية تحتفظ بالبروتينات والملحات المتبقيةقد تترك عينات النباتات سكرات كثيرة وصبغات؛ غالبًا ما تنتج عينات الدم تغيرًا في اللون البني أو الأصفر. تقوم خطوات الغسيل بإزالة هذه الملوثات.

غسيلين نموذجيين، على الرغم من أن الأرقام الدقيقة تعتمد على نوع العينة. الغسيل الأول عادة ما يحتوي على تركيزات منخفضة من الكاوتروب لإزالة البروتينات والصبغات المتبقية،تليها غسيل الإيثانول لإزالة الأملاحقد تتطلب عينات منخفضة البروتينات في البداية (على سبيل المثال، تحضيرات البلازميد أو تنقية منتجات PCR) غسل الإيثانول فقط. يثبت الإزالة الكاملة للكاوتروب ضرورية لتحقيق إنتاج عال ونقاء.بعض المجموعات توصي بغسل إيثانول مزدوجالملحات المتبقية تمنع الانبعاث، مما يقلل من الغلة ويزيد من قراءات A230 التي تقلل من نسبة A260/230

تتضمن معظم البروتوكولات الطرد المركزي بعد الغسيل لتجفيف الإيثانول المتبقي من الأعمدة. تثبت هذه الخطوة أنها حاسمة بالنسبة للمواد النظيفة.إضافة عازل Tris 10 ملم أو الماء ثم إعادة ترطيب الأحماض النووية لتحرير الغشاءالإيثانول المتبقي يمنع إعادة التجفيف الكامل والإزالة بينما الإيثانول غير قابل للكشف عن طريق الطيفعلامات واضحة تشمل عدم استقرار العينات في آبار جيل الأغاروز (حتى مع وجود صبغة تحميل) أو عدم القدرة على التجمد عند -20 درجة مئوية.

الخطوة النهائية لاستخراج الحمض النووي تحرير الأحماض النووية النقية من السيليكا. للحمض النووي، 10 م م تريس عند حمق الحمض النووي 8-9 هو القياسية.يظل الحمض النووي أكثر استقراراً في درجة الحموضة القائمة على القليل من القليات ويحل بسرعة أكبر في العازل من الماء. حتى هبات الحمض النووي تتصرف بشكل مماثل. عادة ما يظهر الماء درجة حموضة أقل (4-5) ، وقد لا يعيد الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي الهيدراتية بسرعة. لتحقيق أقصى استرداد للحمض النووي ، يجب أن يكون الحمض النووي الذي يتم استخدامه في الحمضدع العازل يجلس على الأغشية لعدة دقائق قبل الطرد المركزي. للتطبيقات التي تتطلب حميمية الحمض النووي ذات الوزن الجزيئي العالي (على سبيل المثال، تسلسل القراءة الطويلة) ، تعتبر عازلات الانسحاب مثالية. يتسامح الحمض النووي النووي الحمضي ضعيفًا ويدخل بسهولة في الماء.مما يجعل الماء هو المادة المخففة المفضلة.

حتى بعد اتباع البروتوكولات القياسية، الاستخراجات يمكن أن تواجه العديد من المشاكل:

• إنتاج منخفض:غالباً ما تنبع من الانزلاق غير الكامل أو ظروف الارتباط غير المثلى. استخدم دائمًا الإيثانول الخالي من الماء الطازج عالي الجودة لتخفيف العازل وخطوات الارتباط.الإيثانول السيئ الجودة أو القديم قد يمتص الرطوبةتغيير التركيزات العاملة. تذكر أن المكافئات الغسيل غير المعدة بشكل صحيح يمكن أن تجرد الأحماض النووية المستخرجة!
• نقاء منخفض:غالبًا ما يكون تلوث البروتين نتيجة لمادة البداية المفرطة مما يزيد من خطر الانحلال غير الكامل. عادة ما تشير نسبة A260/230 المنخفضة إلى الملحات المتبقية أو الغسل غير الكافي.استخدم الإيثانول من أعلى جودة لمدافع الغسيل، وإذا استمرت المشاكل، أضف خطوات غسل إضافية.
• الملوثات:تثبت عينات البيئة حساسيتها بشكل خاص للمواد الهيومية التي تنظف مع الحمض النووي وتقاوم إزالة عمود السيليكا.تقنيات متخصصة يمكن أن تزيل البروتينات المتداخلة والحوميات قبل ربط العمود.
• التدهور:يواجه الحمض النووي الحمض النووي مخاطر تدهور أكبر، عادةً من تخزين العينات غير السليم أو التحليل غير الفعال (على افتراض استخدام الماء الخالي من RNase).التدهور أقل أهمية لتطبيقات PCR ولكنه يصبح حاسمًا لترتيب القراءة الطويلة التي تتطلب حميمية الحمض النووي ذو الوزن الجزيئي العالي!
• تنقية منتج PCR:على الرغم من أنه ليس استخراج الحمض النووي بدقة ، إلا أنه يستحق الذكر. عادةً ما يتم إضافة 3-5 أحجام من محلول الملح لكل حجم تفاعل PCR قبل تنقية عمود الدوران.عادة ما تنبعث التطهيرات الفاشلة من فشل PCR، ولكن توفير التدفق هو أمر حكيم إذا لم تلتصق أشرطة PCR الواضحة بالعمودات ، فمن المحتمل أن تظل في التدفق لاستردادها وإعادة تنقيتها.

يمكن أن تظهر الانزلاق غير الكامل على شكل انخفاض غير متوقع في الغلة، أو حل البروتين غير الكامل، أو ضعف نسبة A260/230.هذا يشير إلى أن بعض مكونات العينة لم تتمكن من التخلص منها أو إذابتها بالكامل أثناء الاستخراجيتطلب التمييز بين التحلل غير الكامل والتلوث أو التدهور تحليلًا دقيقًا لظروف الاستخراج ، بما في ذلك تكوين عازل التحلل ، ومعلمات الحضانة ،والمواد المتداخلة المحتملةعلى سبيل المثال ، قد تشير نسبة A260/230 الضعيفة إلى الملحات المتبقية بعد الارتباط أو الغسيل غير الكافي بدلاً من التحلل غير الكامل.قد يتطلب معالجة الانقسام غير الكامل تحسين مكونات عازل الانقسام، أوقات الحضانة، أو دمج أساليب تحلل ميكانيكية / إنزيمية إضافية.

تستهدف التقنيات المتخصصة إزالة المواد الهيومية وغيرها من المتداخلين الذين قد يشاركون في تنقية الأحماض النووية من عينات البيئة.وتشمل هذه المكافئات الاستخراجية المتخصصة التي تحتوي على العوامل الكيلية(مثل EDTA) لربط و إزالة الكاتيونات بشكل انتقائي.يمكن أن تساعد طرق المعالجة المسبقة مثل الطرد المركزي أو التصفية على إزالة الجسيمات الكبيرة من العينات البيئية قبل استخراج حمض النووي، مما يقلل من التداخل خلال خطوات الارتباط.

بعض العينات (على سبيل المثال الأنسجة أو المواد الغنية بالدهون) تقدم تحديات خاصة.عادةً ما تتطلب عينات الأنسجة اضطرابًا ميكانيكيًا إضافيًا أو هضمًا إنزيميًا لضمان الانزيم الكامل وإفراز حمض النوكلييكقد تعقد العينات الغنية بالدهون تنقية الدهون لأن الدهون يمكن أن تتداخل مع ربط حمض النوكلييك بالمصفوفات العمودية. قد يتطلب معالجة هذه التحديات تعديل تكوين بوفر التحلل ،تحسين بروتوكولات التنقيةأو باستخدام مجموعات مصممة خصيصا.

نشرت في الأصل في 28 يونيو 2010. تم مراجعتها وإعادة نشرها في مايو 2021 ومارس 2024.