بينما تستمر جائحة كوفيد-19 في طرح تحديات عالمية، يظل اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) هو المعيار الذهبي لتشخيص عدوى فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2). ولكن كم عدد الأشخاص الذين يفهمون حقًا المبادئ العلمية وراء هذه الأداة التشخيصية الحاسمة؟ تقدم هذه المقالة شرحًا متعمقًا ولكنه سهل الوصول إليه لاختبار RT-PCR، مما يساعد كلاً من المهنيين الطبيين وعامة الناس على فهم هذه التكنولوجيا الحيوية بشكل أفضل.
RT-PCR، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الفعلي، هي تقنية بيولوجيا جزيئية حساسة وسريعة للغاية تستخدم للكشف عن مواد وراثية معينة في العينات. يمكن أن تنشأ هذه المادة الوراثية من البشر أو البكتيريا أو الفيروسات مثل فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
التكنولوجيا الأساسية وراء RT-PCR هي PCR، التي اخترعها كاري بي موليس في الثمانينيات (مما منحه جائزة نوبل). يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم واكتشاف أهداف الحمض النووي المحددة. مكنت التحسينات اللاحقة من التصور "في الوقت الفعلي" وقياس أهداف الحمض النووي أثناء التضخيم. في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، ترتبط شدة التألق من المجسات المتخصصة بكمية الحمض النووي المتضخم.
ومع ذلك، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي يكتشف الحمض النووي فقط. نظرًا لأن فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2) يحتوي على مادة وراثية من الحمض النووي الريبي (RNA)، فإن الاختبار يتطلب إنزيم النسخ العكسي لتحويل الحمض النووي الريبي إلى حمض نووي مكمل (cDNA). هذه الخطوة العكسية للنسخ، جنبًا إلى جنب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، تجعل RT-PCR أداة قوية للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي مثل فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
يتطلب فهم RT-PCR معرفة أساسية بالمادة الوراثية - دليل التعليمات الذي يحكم السلوك الخلوي والفيروسي والبقاء والتكاثر. تأتي المادة الوراثية في شكلين أساسيين: الحمض النووي (حمض الديوكسي ريبونوكليك) والحمض النووي الريبي (حمض ريبونوكليك). يتميز الحمض النووي ببنية مزدوجة السلاسل بينما الحمض النووي الريبي أحادي السلاسل. للأغراض التشخيصية، فإن استقرار الحمض النووي الأكبر يجعله مفضلاً لاختبار الأمراض المعدية. والجدير بالذكر أن فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2) يحتوي على الحمض النووي الريبي فقط.
تشترك جميع الفيروسات في خاصية الاعتماد على الخلايا المضيفة للبقاء والتكاثر. يغزو فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2)، مثل الفيروسات الأخرى، الخلايا السليمة للتكاثر. عندما تحدث العدوى، يطلق الفيروس الحمض النووي الريبي الخاص به ويختطف الآلية الخلوية للتكاثر. طالما بقيت المادة الوراثية الفيروسية في الخلايا، يمكن لـ RT-PCR اكتشاف عدوى فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
يقوم العاملون الصحيون المدربون بجمع عينات مسحات الأنف البلعومية، والتي يتم وضعها بعد ذلك في أنابيب معقمة تحتوي على وسط نقل فيروسي للحفاظ على سلامة الفيروس.
في المختبر، يستخلص الباحثون الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات تنقية تجارية. ثم تضاف عينة الحمض النووي الريبي إلى مزيج تفاعل يحتوي على جميع المكونات الضرورية للاختبار، بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي، والنسخ العكسي، واللبنات الأساسية للحمض النووي، والمجسات والبادئات الفلورية المحددة لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل فقط مع قوالب الحمض النووي، فإن النسخ العكسي يحول كل الحمض النووي الريبي في العينة (بما في ذلك الحمض النووي الريبي البشري والبكتيري وفيروس كورونا الآخر، وربما الحمض النووي الريبي لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2)) إلى cDNA.
تتضمن هذه العملية ثلاث خطوات متكررة:
تتكرر العملية عادة 40 مرة، مما يضاعف الحمض النووي المستهدف مع كل دورة. ترتبط المجسات الفلورية أسفل المركبات الأولية، مما يؤدي إلى إطلاق إشارات يمكن اكتشافها مع كل تضخيم للحمض النووي. يرتبط زيادة الحمض النووي المستهدف بزيادة شدة التألق.
تولد بيانات التألق قيمة "عتبة الدورة" (Ct) - عدد الدورات اللازمة لكي تتجاوز الإشارة مستويات الخلفية. تتضخم العينات التي تحتوي على المزيد من الحمض النووي المستهدف بشكل أسرع، مما يتطلب عددًا أقل من الدورات (قيم Ct أقل). على العكس من ذلك، تتطلب المادة الوراثية المستهدفة النادرة المزيد من الدورات (قيم Ct أعلى).
توفر قيم Ct معلومات حاسمة حول الحمل الفيروسي. تشير قيم Ct المنخفضة إلى كميات أعلى من الجينوم الفيروسي، بينما تشير القيم الأعلى إلى كميات أقل. يجمع مقدمو الرعاية الصحية بين قيم Ct والأعراض والقصة السريرية لتقييم مرحلة المرض. تساعد قيم Ct المتسلسلة من الاختبارات المتكررة في مراقبة تطور المرض والتنبؤ بالشفاء. يستخدم متعقبو الاتصال أيضًا قيم Ct لإعطاء الأولوية للمرضى الذين لديهم أعلى أحمال فيروسية (وبالتالي أكبر خطر للانتقال).
على الرغم من كونه المعيار الذهبي لتشخيص كوفيد-19، إلا أن RT-PCR له قيود:
لا يزال اختبار RT-PCR ضروريًا لتشخيص كوفيد-19 عن طريق اكتشاف المادة الوراثية لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2). تعمل قيم Ct كمؤشرات حيوية للحمل الفيروسي، وتطور المرض، وخطر الانتقال. ومع ذلك، تتطلب قيود الاختبار الجمع بين النتائج والتقييم السريري للتشخيص والإدارة الدقيقة.
بينما تستمر جائحة كوفيد-19 في طرح تحديات عالمية، يظل اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR) هو المعيار الذهبي لتشخيص عدوى فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2). ولكن كم عدد الأشخاص الذين يفهمون حقًا المبادئ العلمية وراء هذه الأداة التشخيصية الحاسمة؟ تقدم هذه المقالة شرحًا متعمقًا ولكنه سهل الوصول إليه لاختبار RT-PCR، مما يساعد كلاً من المهنيين الطبيين وعامة الناس على فهم هذه التكنولوجيا الحيوية بشكل أفضل.
RT-PCR، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الفعلي، هي تقنية بيولوجيا جزيئية حساسة وسريعة للغاية تستخدم للكشف عن مواد وراثية معينة في العينات. يمكن أن تنشأ هذه المادة الوراثية من البشر أو البكتيريا أو الفيروسات مثل فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
التكنولوجيا الأساسية وراء RT-PCR هي PCR، التي اخترعها كاري بي موليس في الثمانينيات (مما منحه جائزة نوبل). يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم واكتشاف أهداف الحمض النووي المحددة. مكنت التحسينات اللاحقة من التصور "في الوقت الفعلي" وقياس أهداف الحمض النووي أثناء التضخيم. في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، ترتبط شدة التألق من المجسات المتخصصة بكمية الحمض النووي المتضخم.
ومع ذلك، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي يكتشف الحمض النووي فقط. نظرًا لأن فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2) يحتوي على مادة وراثية من الحمض النووي الريبي (RNA)، فإن الاختبار يتطلب إنزيم النسخ العكسي لتحويل الحمض النووي الريبي إلى حمض نووي مكمل (cDNA). هذه الخطوة العكسية للنسخ، جنبًا إلى جنب مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي، تجعل RT-PCR أداة قوية للكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي مثل فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
يتطلب فهم RT-PCR معرفة أساسية بالمادة الوراثية - دليل التعليمات الذي يحكم السلوك الخلوي والفيروسي والبقاء والتكاثر. تأتي المادة الوراثية في شكلين أساسيين: الحمض النووي (حمض الديوكسي ريبونوكليك) والحمض النووي الريبي (حمض ريبونوكليك). يتميز الحمض النووي ببنية مزدوجة السلاسل بينما الحمض النووي الريبي أحادي السلاسل. للأغراض التشخيصية، فإن استقرار الحمض النووي الأكبر يجعله مفضلاً لاختبار الأمراض المعدية. والجدير بالذكر أن فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2) يحتوي على الحمض النووي الريبي فقط.
تشترك جميع الفيروسات في خاصية الاعتماد على الخلايا المضيفة للبقاء والتكاثر. يغزو فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2)، مثل الفيروسات الأخرى، الخلايا السليمة للتكاثر. عندما تحدث العدوى، يطلق الفيروس الحمض النووي الريبي الخاص به ويختطف الآلية الخلوية للتكاثر. طالما بقيت المادة الوراثية الفيروسية في الخلايا، يمكن لـ RT-PCR اكتشاف عدوى فيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
يقوم العاملون الصحيون المدربون بجمع عينات مسحات الأنف البلعومية، والتي يتم وضعها بعد ذلك في أنابيب معقمة تحتوي على وسط نقل فيروسي للحفاظ على سلامة الفيروس.
في المختبر، يستخلص الباحثون الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات تنقية تجارية. ثم تضاف عينة الحمض النووي الريبي إلى مزيج تفاعل يحتوي على جميع المكونات الضرورية للاختبار، بما في ذلك بوليميراز الحمض النووي، والنسخ العكسي، واللبنات الأساسية للحمض النووي، والمجسات والبادئات الفلورية المحددة لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2).
نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل يعمل فقط مع قوالب الحمض النووي، فإن النسخ العكسي يحول كل الحمض النووي الريبي في العينة (بما في ذلك الحمض النووي الريبي البشري والبكتيري وفيروس كورونا الآخر، وربما الحمض النووي الريبي لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2)) إلى cDNA.
تتضمن هذه العملية ثلاث خطوات متكررة:
تتكرر العملية عادة 40 مرة، مما يضاعف الحمض النووي المستهدف مع كل دورة. ترتبط المجسات الفلورية أسفل المركبات الأولية، مما يؤدي إلى إطلاق إشارات يمكن اكتشافها مع كل تضخيم للحمض النووي. يرتبط زيادة الحمض النووي المستهدف بزيادة شدة التألق.
تولد بيانات التألق قيمة "عتبة الدورة" (Ct) - عدد الدورات اللازمة لكي تتجاوز الإشارة مستويات الخلفية. تتضخم العينات التي تحتوي على المزيد من الحمض النووي المستهدف بشكل أسرع، مما يتطلب عددًا أقل من الدورات (قيم Ct أقل). على العكس من ذلك، تتطلب المادة الوراثية المستهدفة النادرة المزيد من الدورات (قيم Ct أعلى).
توفر قيم Ct معلومات حاسمة حول الحمل الفيروسي. تشير قيم Ct المنخفضة إلى كميات أعلى من الجينوم الفيروسي، بينما تشير القيم الأعلى إلى كميات أقل. يجمع مقدمو الرعاية الصحية بين قيم Ct والأعراض والقصة السريرية لتقييم مرحلة المرض. تساعد قيم Ct المتسلسلة من الاختبارات المتكررة في مراقبة تطور المرض والتنبؤ بالشفاء. يستخدم متعقبو الاتصال أيضًا قيم Ct لإعطاء الأولوية للمرضى الذين لديهم أعلى أحمال فيروسية (وبالتالي أكبر خطر للانتقال).
على الرغم من كونه المعيار الذهبي لتشخيص كوفيد-19، إلا أن RT-PCR له قيود:
لا يزال اختبار RT-PCR ضروريًا لتشخيص كوفيد-19 عن طريق اكتشاف المادة الوراثية لفيروس كورونا المستجد (SARS-CoV-2). تعمل قيم Ct كمؤشرات حيوية للحمل الفيروسي، وتطور المرض، وخطر الانتقال. ومع ذلك، تتطلب قيود الاختبار الجمع بين النتائج والتقييم السريري للتشخيص والإدارة الدقيقة.
